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新型冠状病毒核酸检测系统的验证

文章来源:检验与临床发布时间:2022年05月15日浏览量:2416次 字体:

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日常督导中,我们发现有些分子生物学实验室对新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测存在模糊不清的问题,结合自己的工作经验,参考有关文献做以下简要说明,希望对大家有所帮助。(仅供参考,不对之处敬请谅解)。

 

一、为什么要进行性能验证?

 

  保证日常检验结果的一致性和可比性;判断检测结果的可靠性;评价厂商的声明;为选择新方法提供依据。

  

二、定性试验性能验证要做哪些内容?

 

  根据《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》(试行第二版)中指出在用于临床标本检测前,实验室应对由提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成检测系统进行必要的性能验证,性能指标包括但不限于精密度(至少要有重复性)和最低检测限。CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》中PCR 定性检测选择验证的性能指标宜包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等。实时荧光定量PCR检测新冠核酸病毒一般需要验证符合率、检出限和精密度。

 

三、在哪些情况下需要进行性能验证?

 

1. 检验程序常规应用前。

2. 任何严重影响检测系统分析性能的情况发生后,应在检测系统重新启用前对受影响的性能进行部分性能验证。现用检测系统的任一要素(仪器、试剂、校准品等)变更,如试剂升级、仪器更新、校准品溯源性改变等应按照新系统来进行验证.

3. 常规使用期间,实验室可基于分析系统的稳定性,利用日常工作产生的检验和质控数据,定期对检验程序的分析性能进行评审,应能满足检验结果预期用途的要求。

 

四、新冠核酸检测系统实验室性能验证方案

分子诊断检验程序的性能参数主要包括 PCR 定性和定量检测、Sanger 测序、二代基因测序(NGS)和原位杂交等。 

PCR 定量检测选择验证的性能指标宜包括测量正确度、测量精密度(含测量重复性和测量中间精密度)、测量不确定度、分析特异性(含抗干扰能力)、分析灵敏度、检出限和定量限、线性区间(可报告区间)等。PCR 定性检测选择验证的性能指标宜包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等。

Sanger 测序和 NGS 选择验证的性能指标宜包括方法符合率和检出限等。原位杂交技术应依据样本类型和预期用途,选用适宜的性能指标进行验证,如基于完整细胞的原位杂交宜选用分析敏感性和特异性,基于组织的宜选用方法符合率。

参照CNAS-GL0392019《分子诊断检验程序性能验证指南》和CNAS-GL0372019《临床化学定量检验程序性能验证指南》来制定验证方案。

 

1. 样本准备

样本最好来自患者真实样本,尽量与厂家建立性能指标时所用材料一致。当一份样本需进行多次试验时,对样本进行分装保存,避免反复冻融。因新型冠状病毒不易获得,可以使用三方质控品,经过稀释后获得不同浓度的样本。检测限验证需要定值标准物质(如:国际参考品、国家参考品、厂家参考品)。

 

2. 符合率的验证

验证方案:选择标本阴性标本至少5例,阳性标本不少于10例(应含有弱阳性标本)。

验证要求:相关符合率不低于说明书声明。

阴性标本:5例正常人鼻咽拭子标本N1 N2 N3 N4 N5

阳性标本:可使用国家卫健委或省临检中心下发的室间质控品、实验室内使用的三方质控品。

 

符合率计算及结论

 

符合率计算 

参比方法

总数

阳性

阴性

候选方法

阳性

10

0

10

阴性

0

5

5

总数

/

10

5

15

阳性符合率

 

厂家声明

 

阴性符合率

 

厂家声明

 

总符合率

 

厂家声明

 

验证结果

经验证本系统和厂家声明相符合

 

3. 最低检出限的验证

 

验证方案:定值标准物质(如:国际参考品、国家参考品、厂家参考品)。用样本保存液稀释到厂家声明的检出限浓度。使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限浓度,可重复测定5次或在不同批内对该浓度样本进行20次重复测定(如测定5天,每天测定 4份样本)。

验证要求

A.如果是5次重复检测,必须100%检出靶核酸;

B. 如果是20次检测,必须检出至少18次靶核酸。

 

举例A;准物质浓度:标源质控品含量  3000copies/ml

稀释液:样本保存液

稀释浓度:250copies/ml

厂家声明检出限:250copies/ml

实验数据

样本号

结果

1

阳性

2

阳性

3

阳性

4

阳性

5

阳性

验证结果

经验证本系统最低检出限与厂家声明相符

 

举例B:准物质浓度:标源质控品含量  3000copies/ml

稀释液:样本保存液

稀释浓度:250copies/ml

厂家声明检出限:250copies/ml

实验数据

样本号

结果

1

阳性

2

阳性

...

阳性

...

阳性

19

阳性

 

29

阳性

验证结果

经验证本系统最低检出限与厂家声明相符

 

 

4. 重复性验证

注: 不同厂家试剂的说明书声明的重复性不同,应根据说明书的声明方式去进行验证。

例如以下两家说明书对精密度的声明。


 

验证方案:

A.使用稀释后的阳性对照或临界阳性室内质控品,在同一批内重复测定10次。

B.如需要验证中间精密度,可每天检测1个分析批,每个样本重复检测 35次,连续检测5天。

验证要求:统计靶基因Ct值的平均值和标准差,计算出CV值,批内和批间CV值不应低于试剂说明书声明。 

 

数据计算及结论

举例A:   

样本

样本号

N基因

CT

ORF1ab基因CT

RNaseP基因

CT

 

 

 

 

精密度样本

S3

1

29.2

29.5

28.9

2

29.5

30.1

29.1

3

28.9

30.4

28.4

4

28.7

30.7

28.4

5

29.6

30.8

28.7

6

28.5

30.1

28.5

7

29.3

29.7

28.3

8

29.6

30.5

28.1

9

29.5

30.2

28.5

10

29.4

29.7

28.6

/

平均值

29.22

30.17

28.55

/

SD

0.391

0.44

0.292

结果

CV5%

1.34

1.46

1.02

验证结果

经验证本系统精密度和厂家声明相符合

 

举例B:

每批重复4次,分5个批次,计算批内与批间变异系数。

要求:以CT值计算

精密度验证

重复次数

4

 

批次

5

 
 

重复1

重复2

重复3

重复4

批均值

批标准差

第一天

14.60

15.30

14.60

14.90

14.85

0.33

第二天

14.00

14.70

14.20

14.00

14.23

0.29

第三天

15.30

14.70

14.70

15.30

15.00

0.35

第四天

14.40

15.30

14.30

13.40

14.35

0.78

第五天

13.20

14.20

15.10

15.60

14.53

1.06

批间平均值

14.59

 

批间标准差

0.33

 

批间变异系数

2%

厂家声明

10%

实验室总标准差

0.64

 

总变异系数

4%

厂家声明

10%

验证结果

本系统检测精密度低于厂家声明

 

 

5. 抗干扰能力验证 

 

分子诊断常见的干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子和药物等。实验室可根据临床需求、厂家声明和样本特点(实际可能存在的干扰物质及达到的浓度)选择需要验证的干扰物质及浓度。需要时,也应评估抗凝剂和样本保存液等对结果的影响。

数据结果及结论:

 

6. 交叉反应验证

 

验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测结果的影响。对于病原体核酸检测来说,主要指与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸,宜在病原体感染的医学决定水平进行验证。对于报告具体基因型的方法,应在待测核酸浓度水平验证其它基因型对待测核酸测定的影响。

验证方案:取一定浓度可能和新新冠状病毒(2019-nCoV)核酸存在交叉反应的病原体,加入3份确认的阴性标本或是病毒保存液中,按常规标本操作规程进行测定。

加入病原体:乙型流感病毒标准品等 

数据结果及结论:

 

五、试剂验证除了以上项目,还要注意观察:

1PCR的扩增基线;基线上抬或下降都提示试剂质量问题。

2、扩增曲线;扩增曲线正常是平滑的S型曲线,不能出现二次扩增或其他不正常扩增曲线。

 

注:实验室应根据临床需求选择经确认的符合预期用途的试剂验证检验程序,根据实验室条件,抗干扰能力、交叉反应也可不做。

 

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